X射线的发现起源于阴极射线的研究。阴极射线是在研究真空放电现象时发现的，成为19世纪下半叶物理学家普遍感兴趣的中心问题。
早在20世纪30年代，法拉第就研究了真空放电现象，发现薄气体在放电时会产生光。但由于他没有得到高真空（只有几千分之几的大气压），所以没有更多发现。
1855年，德国波恩大学科学仪器技术人员盖斯勒制造了一个简单的水银泵，并成功地将金属电极密封在玻璃管中，制造了高真空放电管。
从1858年到1859年，德国数学家和物理学家普鲁克用盖斯勒管进行了真空放电实验，发现对阴极的放电管壁上有绿色荧光，磁铁可以移动荧光斑。
10年后，普鲁克的学生希托夫发现放电起源于阴极，并通过直线运动。他推断荧光是由这种射线撞击玻璃管壁而产生的。
1876年，德国物理学家哥尔德施泰因称这种射线为阴极射线。
1879年，英国物理学家克鲁克斯进一步改进了真空泵，制造了更高真空度的阴极射线管，发现阴极射线可以旋转小叶轮，从而推断阴极射线具有动量，是一种带电粒子流。
1894年，赫兹的学生德国实验物理学家勒纳德在放电管的玻璃墙上打开了一扇薄铝窗，成功地将阴极射线射出了管道，但他和赫兹认为阴极射线是一种以太波。
德国物理学家伦琴在探索阴极射线时，一个意外地发现轰动了全。他首先用勒纳德管重做了勒纳德的实验，证明阴极射线可以使放电管附近的荧光屏产生荧光。1895年11月8日晚，他改用克鲁克斯管继续实验。他用黑色纸板密封了放电管，只留下一个狭缝。当他检查是否漏光时，他意外地发现1米外的荧光屏上有闪光。这种现象显然不能用阴极射线的性质来解释，因为阴极射线只能穿透几厘米的空气。经过几周的反复实验，他确信这是一种穿透力强的新型神秘射线，是由阴极射线撞击玻璃管壁而产生的。因为它的性质还不为人所知，他称之为X射线。他发现X射线可以穿透1000页的书，2~3cm厚的木板，15mm厚的铝板；用X射线拍照可以显示木箱里的法码，有绝缘包皮的金属线。其中，特别引人注目的是伦琴夫人手骨的照片，手骨和手指上的结婚戒指清晰可见，这也就是历史上第一张X光图。12月28日，伦琴将他的论文送到维尔茨堡物理医学会出版。几天后，这个消息传播到了世界各地。它在科学史上传播迅速，反应强烈，这是罕见的。
伦琴的论文在三个月内被印刷了五次。首先，X射线在医学上的应用受到了广泛的关注，伦琴夫人的手骨照片成为最轰动的新闻，表明它可以透过皮肉透视骨骼，为医学诊断提供了强有力的新手段。来自世界各地的医学家竞相研究，在骨科和内科都取得了丰硕的成果。关于X射线的各种研究论文如雨后春笋般涌现，一年内有1000多篇论文，48篇专著等等。然而，当时的肆意宣传并不符合伦琴的初衷。他认为X射线摄影只是一种手段，他的目的是深入研究X射线的本质。只是，由于当时条件不成熟，研究进展不大，他在1896-1897年内只发表了两篇论文，然后回到原来的研究课题，把X射线的研究留给别人。
X射线的发现不仅给医疗保健事业带来了新的希望，也开启了物理革命的序幕。它打破了当时物理学家的现有格局，展示了物理学和未知领域需要我们不断探索。
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